BCA蛋白定量檢測試劑盒

使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

第1版（2016年04月修訂）

關(guān)聯(lián)信息

BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）是根據(jù)目前世界上最常用的兩種蛋白濃度檢測方法中的BCA（bicinchoninic acid，二喹啉甲酸）法研制而成，其基本原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與Cu2+ 生成絡(luò)合物，并將Cu2+還原成Cu+，BCA試劑會靈敏的與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定有顏色的復(fù)合物，并在562 nm 處有最大光吸收值，這樣通過判斷反應(yīng)混合液顏色的深淺便能測定蛋白含量。該檢測試劑盒能對蛋白質(zhì)進(jìn)行快速、穩(wěn)定、靈敏的濃度測定，檢測濃度下限最低達(dá)到20μg/ml，并在50-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

試劑盒組分

名稱	規(guī)格1-100T	規(guī)格2-500T	規(guī)格3-2000T?
BCA試劑A	20ml	100ml	400ml
BCA試劑B	1ml	3ml	12ml
BSA 標(biāo)準(zhǔn)品	2mg	7.5mg	30mg
產(chǎn)品說明書	1	1	1

儲存及有效期

BCA試劑A、BCA試劑B保存在-4℃；BSA 標(biāo)準(zhǔn)品-20℃保存。試劑盒質(zhì)保期一年。
注：如果在寒冷天氣進(jìn)行運(yùn)輸，或在保存期間，試劑 A 或試劑 B 發(fā)生沉淀，可通過對溶液進(jìn)行溫和加熱和攪拌，使沉淀溶解。當(dāng)試劑盒發(fā)生變色或證明有微生物污染時，請將試劑丟棄。

樣本處理

1、將樣品的濃度稀釋或者濃縮到試劑盒的檢測范圍20-2,000μg/ml。
2、樣品中的干擾物質(zhì)不能含有或者超過額定量（詳細(xì)見附表）。
3、樣品中干擾物質(zhì)的處理方法：
1)  通過透析或凝膠過濾來除去干擾物質(zhì)；
2)  對樣品進(jìn)行稀釋，直到該物質(zhì)不再產(chǎn)生干擾為止。只有當(dāng)起始蛋白質(zhì)濃度足夠高，在稀釋以后，其濃度仍能保持在定量分析的范圍內(nèi)時，這種方法才有效；
3)  用丙酮或三氯乙酸（TCA）沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。將含有干擾物質(zhì)的液體成分丟棄，蛋白質(zhì)沉淀可復(fù)溶于超純水中，或直接溶解在堿性 BCA 工作液中；
4)  增加工作液中銅離子的含量（試劑 A 與試劑 B 的以 50:2 或 50:3 的比例混合制備工作液），這種方法可以消除銅螯合劑導(dǎo)致的干擾。
注：為了獲得最高的準(zhǔn)確度，必須對蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測樣品進(jìn)行相同的處理。

試劑準(zhǔn)備

1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋
按照下表制備一組蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。向1瓶牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）中加入1 ml緩沖液，成為2mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品，最好使用與待測樣品相同的緩沖液。每一支2 mg/ml 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品足夠用于制備下表中所列出的任意一組稀釋范圍的標(biāo)準(zhǔn)品；每個稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的體積足夠用于3次重復(fù)檢測。    
   用于標(biāo)準(zhǔn)方案的稀釋方法如下：
 

標(biāo)準(zhǔn)液編號	稀釋液體積（μl）	標(biāo)準(zhǔn)品體積（μl）	標(biāo)準(zhǔn)液終濃度（μg/ml）
1	0	300	2000
2	125	375μl of standard1	1500
3	325	325μl of standard 1	1000
4	175	175μl of standard 2	750
5	325	325μl of standard 3	500
6	325	325μl of standard 5	250
7	325	325μl of standard 6	125
8	400	100μl of standard 7	25
9	400	0	0

2、按50體積BCA試劑A加入1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

操作步驟

1、將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按25μl/孔的要求，分別加入96T板的板孔內(nèi)；
2、各孔加入200μl BCA 工作液，置于水平搖床輕輕震蕩混勻，37℃放置30分鐘；
3、將96孔板冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測定A562吸光度（如果沒有該波長，540nm-595nm之間的任意波長均可測定）
4、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值和濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品濃度(使用與酶標(biāo)板相關(guān)聯(lián)的曲線擬合算法，二次方程等曲線擬合將會比簡單的線性擬合提供更加準(zhǔn)確的結(jié)果。如果手工對這些結(jié)果作圖，對于標(biāo)準(zhǔn)曲線上的各個點(diǎn)，采取點(diǎn)對點(diǎn)描畫曲線的方法，比直接進(jìn)行線性擬合的結(jié)果更好)

注意事項(xiàng)

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為20-2,000μg/ml。
2、樣品中各干擾檢測的物質(zhì)含量需低于臨界值。
3、BCA工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

問題及解決方案

常見問題	原因	解決辦法
樣品不顯色	樣品中含有銅離子螯合劑	將樣品進(jìn)行透析、脫鹽或者稀釋；加大工作液中銅離子的濃度，如將A液和B液的比例調(diào)整為50:2
	樣本中蛋白濃度過低	濃縮樣本
空白孔吸光值正常，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔吸光值偏低	強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿緩沖液改變了工作液的PH值	將樣品進(jìn)行透析、脫鹽或者稀釋
	選擇了錯誤的測定波長	在540nm-595nm之間的之間的波長范圍內(nèi)進(jìn)行測定
樣品孔吸光值偏高	蛋白濃度過高	將樣品進(jìn)行稀釋
	樣品中含有脂類或者脂蛋白	在樣品中加入2%SDS以去除脂類干擾
所有孔包括空白孔呈現(xiàn)深紫色	樣品中含有還原劑或者胺類（如兒茶酚胺）	將樣品進(jìn)行透析或者稀釋